上海通蔚生物帶您了解Elisa的原理、操作及注意事項(xiàng)

一、基本原理
通過(guò)抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗原也可以是抗體。
ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。
   用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化水解或氧化還原反應(yīng)而成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。         由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。
所生成有色產(chǎn)物的顏色深淺與欲測(cè)的抗原(抗體)含量成正比。 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)(酶標(biāo)儀)加以測(cè)定。其方法簡(jiǎn)單，方便迅速，特異性強(qiáng)。
二、ELISA實(shí)驗(yàn)方法
ELISA根據(jù)不同的設(shè)計(jì)可以分為直接法、間接法、夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法。
1.直接ELISA：降抗原通過(guò)吸附等方法直接固定在固相載體上，經(jīng)過(guò)洗滌后，加入酶偶聯(lián)的的檢測(cè)抗體結(jié)合。然后加入底物，酶催化底物產(chǎn)生與待測(cè)抗原的量成正比的顯色信號(hào)。直接ELISA常用于評(píng)估抗體的親和力和特異性、研究阻斷/抑制相互作用。直接ELISA具有快速、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，但由于僅使用一種抗體，特異性較低，可能會(huì)產(chǎn)生較高的背景信號(hào)。
2.間接ELISA：將抗原通過(guò)吸附等方法直接固定在固相載體上，經(jīng)過(guò)洗滌后，先添加能與抗原特異性結(jié)合的一抗進(jìn)行孵育，再次清洗后，通過(guò)添加對(duì)一抗種屬具有特異性的酶偶聯(lián)的二抗來(lái)檢測(cè)結(jié)合的一抗。在底物的存在下，酶催化底物產(chǎn)生與待測(cè)抗原的量成正比的顯色信號(hào)。間接ELISA是直接ELISA的基礎(chǔ)上加入在酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)的一種常見(jiàn)形式，常用于內(nèi)源性抗體的檢測(cè)。間接ELISA利用二抗進(jìn)行了擴(kuò)增，特異性較直接ELISA好，但二抗可能會(huì)引起交叉反應(yīng)。
3.夾心ELISA：夾心ELISA是最常見(jiàn)的ELISA類型。兩種特異性抗體用于夾住抗原，通常稱為匹配抗體對(duì)。將捕獲抗體包被在固相載體上，清洗掉多余未結(jié)合的捕獲抗體后，加入樣品，樣品中的目標(biāo)抗原被特異性捕獲。再次清洗后，產(chǎn)生與樣品中存在的目標(biāo)抗原的量成正比的信號(hào)。夾心ELISA需要兩種抗體才能與目標(biāo)抗原結(jié)合，具有高度特異性，能與復(fù)雜的樣本基質(zhì)兼容，常用于生物樣本中目標(biāo)抗原的濃度檢測(cè)，但操作步驟較為繁瑣。
4.競(jìng)爭(zhēng)性ELISA：與夾心ELISA類似，捕獲抗體包被在固相載體上。不使用酶偶聯(lián)的檢測(cè)抗體，而是使用酶偶聯(lián)的抗原與樣品中的目標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)性與捕獲抗體結(jié)合。樣本中存在的目標(biāo)抗原越多，與捕獲抗體結(jié)合的酶偶聯(lián)抗原就越少。加入底物后，產(chǎn)生的信號(hào)與樣品中存在的目標(biāo)抗原的量成反比。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA通常用于目標(biāo)抗原太小而無(wú)法有效的與兩種抗體形成夾心的情況，如小分子和激素的濃度測(cè)定。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA只使用一種抗體，相對(duì)于夾心ELISA的特異性較低，并且需要偶聯(lián)抗原。
三、注意事項(xiàng)：
1.正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
2.在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括:
(1)固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
(2)包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10μg／ml。
(3)酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見(jiàn)酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

(4 ) 酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。

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