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產(chǎn)品及特點(diǎn)
CHO細(xì)胞，即中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary），其逆轉(zhuǎn)錄酶實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性，具有致瘤的風(fēng)險(xiǎn)。這表明CHO細(xì)胞可能攜帶有逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒，其基因整合入受者基因組可能導(dǎo)致感染；如果存在病毒或傳代細(xì)胞基質(zhì)中的致癌基因，則可能具有引發(fā)腫瘤的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，中國(guó)藥典2020年版三部規(guī)定，以細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的生物制劑DNA殘留量不能超過100 pg/劑，以細(xì)菌或真菌基質(zhì)生產(chǎn)的疫苗DNA殘留量不能超過10 ng/劑，同時(shí)也規(guī)定，重組乙型肝炎疫苗中CHO細(xì)胞殘留DNA不得超過10 pg/劑。由于宿主細(xì)胞DNA殘留量的控制是生物制品質(zhì)量控制中非常重要的環(huán)節(jié)，因此本公司基于熒光定量PCR技術(shù)，開發(fā)了專門用于檢測(cè)樣品中CHO細(xì)胞基因組DNA殘留的本產(chǎn)品，它具有下列特點(diǎn)：
CHO細(xì)胞，即中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary），其逆轉(zhuǎn)錄酶實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性，具有致瘤的風(fēng)險(xiǎn)。這表明CHO細(xì)胞可能攜帶有逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒，其基因整合入受者基因組可能導(dǎo)致感染；如果存在病毒或傳代細(xì)胞基質(zhì)中的致癌基因，則可能具有引發(fā)腫瘤的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，中國(guó)藥典2020年版三部規(guī)定，以細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的生物制劑DNA殘留量不能超過100 pg/劑，以細(xì)菌或真菌基質(zhì)生產(chǎn)的疫苗DNA殘留量不能超過10 ng/劑，同時(shí)也規(guī)定，重組乙型肝炎疫苗中CHO細(xì)胞殘留DNA不得超過10 pg/劑。由于宿主細(xì)胞DNA殘留量的控制是生物制品質(zhì)量控制中非常重要的環(huán)節(jié)，因此本公司基于熒光定量PCR技術(shù)，開發(fā)了專門用于檢測(cè)樣品中CHO細(xì)胞基因組DNA殘留的本產(chǎn)品，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到 0.01 pg/μL。
3. 特異性高，引物和探針是根據(jù)CHO細(xì)胞DNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
4. 既用于定性檢測(cè)，又用于定量檢測(cè)。定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。
5.本產(chǎn)品足夠50次20 μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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2×探針法qPCR MasterMix |
625μL |
1.5mL本色管 |
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CHO細(xì)胞基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品（1E4 pg/μL） |
250μL |
0.5mL綠色蓋 |
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CHO細(xì)胞基因組正向引物干粉 |
50次 |
0.5mL白色蓋 |
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CHO細(xì)胞基因組反向引物干粉 |
50次 |
0.5mL藍(lán)色蓋 |
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CHO細(xì)胞基因組探針干粉 |
50次 |
0.5mL棕色蓋 |
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使用手冊(cè) |
1份 |
無(wú) |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物和探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入138 μL的超純水充分混勻后得到的濃度分別為10 μM再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
按自選方法進(jìn)行核酸純化本試劑盒不相關(guān)試劑
按自選方法進(jìn)行核酸純化本試劑盒不相關(guān)試劑
制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本本試劑盒不相關(guān)試劑
1. 標(biāo)記5個(gè)離心管，分別為5、4、3、2、1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭（下同）。
3. 在5號(hào)管中加入5 μL 1E4 pg/μL的CHO細(xì)胞基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品，
4. 充分震蕩混勻1分鐘，得到1E3 pg /μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號(hào)管中加入5 μL 1E3 pg/μL的CHO細(xì)胞基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品(上步稀釋所得)，充分震蕩混勻1分鐘，得到1E2 pg/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 換槍頭，在3號(hào)管中加入5 μL 1E2 pg/μL的CHO細(xì)胞基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品(上步所得)，充分震蕩混勻1分鐘，得到1E1 pg/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
7. 依次重復(fù)上面的操作得到5個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
Probe qPCR反應(yīng)（25 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行)
8. 配制不含DNA模板的PCR反應(yīng)混合液。如果有N個(gè)待測(cè)樣本，做三次重復(fù)，做一個(gè)無(wú)模板陰性對(duì)照，做5個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣板，每個(gè)PCR反應(yīng)體系為25 mL，則按下表配制PCR mix：
9. 于96孔反應(yīng)板每個(gè)反應(yīng)管中分別加上步制備的PCR混合液20 μL，再在陰性對(duì)照管中加入水5 μL、在3N個(gè)樣本管中加入N個(gè)DNA樣本各5 μL（每個(gè)三次重復(fù)）、在5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線管中加入5個(gè)稀釋度的DNA標(biāo)準(zhǔn)品（來(lái)于第二步）各5 μL。在一個(gè)管中加水25 μL為背景對(duì)照。
10. 反應(yīng)板覆蓋光學(xué)蓋膜后，離心去除氣泡。
11. 將反應(yīng)板放置在熒光定量PCR儀中運(yùn)行反應(yīng)，設(shè)定如下參數(shù)。階段1：95℃，10分鐘。階段2：95℃，15秒，60℃ 1分鐘，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。注：PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件可按照具體使用的儀器及試劑進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，實(shí)驗(yàn)應(yīng)在符合檢測(cè)要求的潔凈條件下進(jìn)行，排除核酸和核酸酶的污染。
數(shù)據(jù)處理
1. 取第3到15次循環(huán)的熒光強(qiáng)度均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)差，或采用陰性對(duì)照熒光值的高點(diǎn)作為熒光閥值。
2. 以至少5個(gè)連續(xù)標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度點(diǎn)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2值應(yīng)≥0.98，斜率應(yīng)在-3.1至-3.8范圍內(nèi)。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品液濃度低點(diǎn)的Ct值，不得高于39。
4. 陰性對(duì)照組若有Ct值時(shí)，不得低于標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度低點(diǎn)的Ct值:
5. 每組加標(biāo)樣品的回收率應(yīng)在50%~150%之間，RSD≤30%。
6. 適當(dāng)情況下，可剔除第一個(gè)或者第六個(gè)點(diǎn)，以連續(xù)5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度點(diǎn)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，系統(tǒng)適用性仍應(yīng)滿足以上條件。
7. 以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的對(duì)數(shù)值對(duì)其相應(yīng)的Ct值作直線回歸，求得直線回歸方程，供試品溶液的Ct值代入直線回歸方程，求出供試品中 DNA殘留量。
自備試劑
熒光PCR專用模板稀釋液
熒光PCR專用模板稀釋液
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年
