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草魚呼腸孤病毒2型探針法qRT-PCR試劑盒

規(guī)格：

品牌 : 通蔚生物
目錄號 : TW-E10484
應用 : 僅限于科研使用
貨期 : 1年
規(guī)格：50T

草魚呼腸孤病毒2型探針法qRT-PCR試劑盒

產品及特點

草魚呼腸孤病毒2型（Grass Carp Reovirus 2,GCRV-2）是一種雙鏈RNA病毒，其對酸堿的耐受能力較強，可以通過水體或寄生蟲傳播給健康的草魚這些易感魚類。草魚呼腸孤病毒2型是目前已知的毒力的呼腸孤病毒，主要引起1齡和2齡草魚出血病，死亡率一般為30~50%，甚至可以高達60~90%。草魚呼腸孤病毒2型不僅能感染草魚，還能感染青魚（Mylopharyngodon piceus）、麥穗魚（Pseudorasbora parva）、稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）等。該病毒流行廣、在中國、越南、緬甸等亞洲國家都有報道，同時其具有的危害大、死亡率高、發(fā)病季節(jié)長等特點，嚴重影響了廣大養(yǎng)殖者的積極性和我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此快速靈敏診斷草魚呼腸孤病毒2型具有重要意義。本產品就是以探針法qRT-PCR技術為基礎開發(fā)的專門檢測草魚呼腸孤病毒2型的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。

2. 引物和探針經過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達到100拷貝/反應。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)草魚呼腸孤病毒2型的保守基因序列設計，不會跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應。

5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。

6. 本產品足夠50次20 μL體系的探針法qRT-PCR反應。

7. 本產品只能用于科研。

規(guī)格及成分

成分	規(guī)格	包裝
探針法qRT-PCR緩沖液	0.5mL	0.5mL本色管
探針法qRT-PCR酶混合液v2	50μL	0.5mL紅蓋管
熒光PCR專用模板稀釋液	1mL	1.5mL綠蓋管
草魚呼腸孤病毒2型qRT-PCR引物-探針干粉	50次	0.5mL棕色管
草魚呼腸孤病毒2型qRT-PCR陽性對照 (1×10E7拷貝/ μL)	50μL	0.5mL黃蓋管
使用手冊	1份	無
本產品采用五孔盒包裝
注意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入162μL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。

使用方法
稀釋標準曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。如果需要RNA陽性樣品，需要另外訂購。

1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。

2. 用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3. 在6號管中加入5μL1×10E7拷貝/ μL的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/ μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在5號管中加入5μL1×10E6拷貝/mL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/mL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在4號管中加入5μL1×10E5拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/mL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

樣品RNA的制備

7. 如果有N個樣品，設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次樣本制備所要求的起始樣本體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。

8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)RNA提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。

Probe qRT-PCR反應20 μL體系，在樣品制備室進行

9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復，則標記N+4個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于RT-PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

數(shù)據(jù)處理

1. 如果樣本制備陽性對照或PCR陽性對照(包括標曲樣本)結果為陰性，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重新樣本制備，重新進行PCR擴增或跟廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對照或PCR陰性對照結果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。

2. 如果陰性對照和陽性對照均正常，則實驗有效，可以進入后續(xù)分析。

3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

4. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無Ct或Ct大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于40，否則實驗無效。如果實驗有效，則分析待測樣品，如果無Ct或Ct大于或等于40，則為陰性。如果Ct小于40則為陽性。

自備試劑
樣品RNA，超純

運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年

021-54845833/15800441009

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