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人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)ELISA試劑盒
簡介
促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH），又稱促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）或促腎上腺皮質(zhì)激素；促腎上腺皮質(zhì)激素也可被稱為皮質(zhì)激素，是一種參與應(yīng)激反應(yīng)的多肽激素。它是一種釋放性激素，由 CRH 基因編碼，屬于促皮質(zhì)素釋放因子家族。CRH 的主要功能是刺激垂體合成 ACTH，作為 HPA 軸的一部分。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）是一種 41 個氨基酸的多肽，來源于 196 個氨基酸的前激素。CRH 由下丘腦室旁核（PVN）分泌，對壓力做出反應(yīng)。已經(jīng)觀察到 CRH 的分泌增加與阿爾茨海默病和重度抑郁癥有關(guān)，常染色體隱性遺傳的下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素缺乏癥有多種潛在的致命的代謝后果，包括低血糖癥。除了在下丘腦中產(chǎn)生外，CRH 還在外周組織中合成，如 T 淋巴細胞，并在胎盤中高度表達。在胎盤中，CRH 是一個決定妊娠期長短以及分產(chǎn)和分娩時間的標志。分娩開始時，CRH 的循環(huán)水平會迅速增加，這表明除了代謝功能外，CRH 還可能作為分娩的觸發(fā)因素。用于診斷的重組版本被稱為 "皮質(zhì)素"（INN）。
檢測原理
本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù) : 將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物CRH，清洗后，再加入生物素標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中CRH的濃度。
需要的其他材料
1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。
樣品保存
樣品收集后若在 1 周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
試劑準備工作
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標準品配置
試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從10ng/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至500pg/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的500pg/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將500pg/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為: 500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、15.625pg/mL、7.813pg/mL，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0pg/mL)。
抗體工作液配置
使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據(jù)所需用量當日配置當日使用。
酶結(jié)合物工作液配置
使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據(jù)所需用量配置。
備 注：如待測樣本CRH濃度高于標準品最高值，請根據(jù)實際情況選擇適當?shù)南♂尡稊?shù)。
結(jié)果的計算
計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。若樣品OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
示例數(shù)據(jù)
標準品濃度(pg/mL)
500
250
125
62.5
31.25
15.625
7.813
0
OD值
2.428
1.794
1.022
0.698
0.365
0.211
0.128
0.057
校正OD值
2.371
1.737
0.965
0.641
0.308
0.154
0.071
0.0
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標準曲線。
下圖所示標準曲線僅供示例，結(jié)果計算應(yīng)以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結(jié)果
重復性
板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。
靈敏度
經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為3.91pg/mL。
特異性
該試劑盒測定可識別重組人CRH。
其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。
使用ELISA試劑盒之前，請您必須完整閱讀說明書，本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷和治療。
