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人Y染色體探針法qPCR試劑盒
規(guī)格及成分
產(chǎn)品及特點(diǎn)
人Y染色體上95%是男性特異區(qū)域，里面含和男性有關(guān)的基因。本產(chǎn)品就是以其中一個(gè)基因?yàn)榘蟹肿樱O(shè)計(jì)的探針法熒光定量PCR產(chǎn)品，專門用于檢測(cè)樣品中是否有人Y染色體存在，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到10拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽性對(duì)照，便于排除假陰性實(shí)驗(yàn)。
4. 能檢測(cè)內(nèi)源性內(nèi)參基因（位于X染色體），便于排除假陰性樣品。
5. 特異性高，引物是根據(jù)人Y染色體高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟人的其他染色體的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
6. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量時(shí)其線性范圍不少于5個(gè)數(shù)量級(jí)。
7. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。
8. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5mL |
0.5mL本色管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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人Y染色體專一性引物-探針混合液（含內(nèi)參） |
150μL |
0.5mL棕色管 |
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人男性基因組DNA陽性對(duì)照(1×10E4拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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KI多瘤病毒qPCR陽性對(duì)照(1E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL白蓋管 |
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使用手冊(cè) |
1份 |
無 |
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本產(chǎn)品采用5孔盒包裝 |
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使用方法
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以10E0-10E4拷貝/μL這5個(gè)10倍稀釋度為例
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以10E0-10E4拷貝/μL這5個(gè)10倍稀釋度為例
1. 標(biāo)記4個(gè)離心管，分別為3，2，1，0。
2. 分別加入45μL 熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭（下同）。
3. 在3號(hào)管中加入5μL 1×10E4拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E3拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在2號(hào)管中加入5μL 1×10E3拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E2拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在1號(hào)管中加入5μL 1×10E2拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E1拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 換槍頭，在0號(hào)管中加入5μL 1×10E1拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E0拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
7. 上面的操作得到0-3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，將試劑盒提供的人男性基因組DNA陽性對(duì)照(1×10E4拷貝/μL)當(dāng)成4號(hào)樣品，共5個(gè)樣品，放冰上待用。
樣品DNA的制備
8. 如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對(duì)照，選用確定含Y染色體的樣本），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照，選用確定不含Y染色體的樣本）。
9. 用自選方法純化樣品DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上大多數(shù)DNA提取試劑盒兼容。
Probe qPCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
10. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+8個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（本試劑盒提供的人女性DNA溶液），5個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（本試劑盒提供的人女性DNA溶液），1個(gè)用于PCR陽性對(duì)照（本試劑盒提供的人男性DNA陽性對(duì)照）。下面只以定量分析為例。
數(shù)據(jù)處理
1. 陰性陽性判斷：沒有Ct讀數(shù)，或Ct大于45的PCR反應(yīng)結(jié)果判為陰性。有Ct讀數(shù)，Ct值小于45，熒光信號(hào)有對(duì)數(shù)增長，有典型倒S型擴(kuò)增曲線的PCR反應(yīng)結(jié)果判為陽性。每個(gè)PCR反應(yīng)管需要同時(shí)對(duì)FAM通道和Cy5通道的結(jié)果分別進(jìn)行判定，得到對(duì)應(yīng)靶分子和內(nèi)參的兩個(gè)結(jié)果。
2. PCR實(shí)驗(yàn)有效性判斷：如果樣本制備陽性對(duì)照管或擴(kuò)增陽性對(duì)照管FAM通道結(jié)果為陰性，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要分析原因，可能是操作、儀器和試劑三方面的原因，重做擴(kuò)增或制備或跟儀器和試劑廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對(duì)照管或擴(kuò)增陰性對(duì)照管FAM通道結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要分析失敗原因，直到污染消除。如果上述陽性對(duì)照管和陰性對(duì)照管結(jié)果正常，則進(jìn)入下一步。
3. 樣本有效性判斷：如果樣本管FAM通道的結(jié)果為陽性，Cy5通道結(jié)果是陰性，則樣本的陽性結(jié)果有效。如果樣本管FAM通道和Cy5通道的結(jié)果均為陽性，并且FAM通道的Ct值小于Cy5通道的Ct值，則樣本的陽性結(jié)果有效。如果FAM通道的Ct值大于Cy5通道的Ct值，則樣本的陽性結(jié)果無效。如果樣本管FAM通道和Cy5通道的結(jié)果均為陰性，則此樣品管的陰性結(jié)果無效?？赡茉蚴菢颖緛G失或有抑制劑，需要用其所對(duì)應(yīng)的樣品重新提取核酸和進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
4. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，分別以陽性對(duì)照FAM通道和內(nèi)參Cy5通道的Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，陽性對(duì)照FAM通道讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為斜線，r2必須大于0.95。內(nèi)參Cy5通道讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線將跟FAM的標(biāo)準(zhǔn)曲線平行。再以待測(cè)樣品的Ct值從陽性對(duì)照FAM通道讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再換算成濃度X拷貝/反應(yīng)。
5. 如果用于定性實(shí)驗(yàn)，對(duì)待測(cè)樣品，如果其FAM通道的Ct沒有讀數(shù)、或Ct大于或等于45則均為陰性，如果小于45則為陽性。對(duì)任何FAM通道結(jié)果為陰性的待測(cè)樣本，如果其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參Cy5通道也為陰性，則此樣品的陰性結(jié)果無效，此樣品需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
自備試劑
樣品DNA
樣品DNA
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
