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測(cè)定意義
輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要?dú)涫荏w，生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成ATP的同時(shí)，形成大量的ROS，同時(shí)NADH再生為NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過(guò)這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于評(píng)價(jià)糖酵解和TCA循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD+比值說(shuō)明細(xì)胞呼吸耗氧量較高，處于過(guò)氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外，NAD+降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。
測(cè)定原理
分別用酸性和堿性提取液提取樣本中NAD+和NADH，在1-mPMS作用下，WST-8可與NADH 反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰，而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進(jìn)一步采用WST-8檢測(cè)。
需自備的儀器和用品
酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、水浴鍋、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
測(cè)定步驟
1、酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm，蒸餾水調(diào)零。
2、加樣表(在96孔板中按下表依次加樣）：
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試劑名稱（μL） |
測(cè)定管 |
空白管 |
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樣本 |
20 |
- |
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蒸餾水 |
- |
20 |
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試劑一 |
160 |
160 |
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試劑二 |
10 |
10 |
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試劑三 |
10 |
10 |
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充分混勻，37℃孵育30min后于450nm處測(cè)定吸光值A(chǔ) , 計(jì)算△A=A測(cè)定管-A空白管。 |
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預(yù)實(shí)驗(yàn)的意義
比色法檢測(cè)試劑盒預(yù)實(shí)驗(yàn)非常重要
1、確定該試劑盒是否適合客戶的樣本檢測(cè)，以免造成試劑盒和樣本的浪費(fèi)（比如低表達(dá)處理的樣本）；
2、熟悉生化試劑盒的操作流程，尤其是初次使用生化試劑盒測(cè)定；
3、確定樣本的處理方法及稀釋倍數(shù)是否合適；
4、了解實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象或問(wèn)題，以便于及時(shí)作出調(diào)整；
5、通過(guò)3 - 5組預(yù)實(shí)驗(yàn)，判斷試劑盒對(duì)于樣本的最佳適應(yīng)稀釋濃度范圍，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)樣本稀釋比例。
注意
正式測(cè)定前務(wù)必取 3 - 5 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。
