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人類內源性逆轉錄病毒R家族探針法qRT-LAMP試劑盒
產(chǎn)品及特點
人類內源性逆轉錄病毒（Human Endogenous Retroviruses，HERV）是人類基因組中的一部分，它們源自于靈長類動物進化歷程中遭遇的外源性逆轉錄病毒。這些古老的病毒序列約占人類基因組的8%。在這些人類內源性逆轉錄病毒中，人類內源性逆轉錄病毒R家族（Human Endogenous Retroviruses R family ，HERV-R）尤為典型，它們在人類基因組中留下了約50個不同的拷貝。研究表明，人類內源性逆轉錄病毒R家族序列在特定人體組織中顯示出較高的RNA表達水平，特別是在那些依賴激素的器官和細胞、具有融合功能的組織，以及那些與外界環(huán)境直接接觸的組織中。這些發(fā)現(xiàn)揭示了人類內源性逆轉錄病毒R家族在人類生物學中的潛在作用，尤其是在生殖、免疫反應和神經(jīng)系統(tǒng)功能等方面，因此快速靈敏診斷IPNV具有重要意義。為此本公司根據(jù)探針法qRT-LMAP技術，開發(fā)了簡單快捷的人類內源性逆轉錄病毒R家族qRT-LAMP檢測試劑盒，它具有下列特點：
產(chǎn)品及特點
人類內源性逆轉錄病毒（Human Endogenous Retroviruses，HERV）是人類基因組中的一部分，它們源自于靈長類動物進化歷程中遭遇的外源性逆轉錄病毒。這些古老的病毒序列約占人類基因組的8%。在這些人類內源性逆轉錄病毒中，人類內源性逆轉錄病毒R家族（Human Endogenous Retroviruses R family ，HERV-R）尤為典型，它們在人類基因組中留下了約50個不同的拷貝。研究表明，人類內源性逆轉錄病毒R家族序列在特定人體組織中顯示出較高的RNA表達水平，特別是在那些依賴激素的器官和細胞、具有融合功能的組織，以及那些與外界環(huán)境直接接觸的組織中。這些發(fā)現(xiàn)揭示了人類內源性逆轉錄病毒R家族在人類生物學中的潛在作用，尤其是在生殖、免疫反應和神經(jīng)系統(tǒng)功能等方面，因此快速靈敏診斷IPNV具有重要意義。為此本公司根據(jù)探針法qRT-LMAP技術，開發(fā)了簡單快捷的人類內源性逆轉錄病毒R家族qRT-LAMP檢測試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒RNA樣品。
2. 恒溫擴增，反應設置更加簡單。
3. 含熒光探針，可以對擴增進行實時熒光檢測（需要熒光PCR儀）。
4. 檢測靈敏性一般比RT-PCR高10倍以上。
5. 特異性高，引物是根據(jù)人類內源性逆轉錄病毒R家族RNA保守序列設計的，不會跟其他型別?？虏《炯捌渌锏腞NA發(fā)生交叉反應。
6. 一般30分鐘內出結果，比qRT-PCR快。
7. 提供無傳染性的陽性對照，便于分析實驗結果。
8. 上樣量大，對20 μL的反應體系，樣品加樣量高達到14 μL。
9. 內含的dUTP-UNG可防交叉污染。
10. 本產(chǎn)品足夠50次20 μL體系的探針法qRT-LAMP擴增。
11. 本產(chǎn)品只可用于科研。
規(guī)格及成分
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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RT-LAMP MasterMix（探針法待加酶） |
200μL |
0.5mL本色蓋 |
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逆轉錄酶-擴增酶混合液 |
100μL |
0.5mL紅蓋管 |
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20×人類內源性逆轉錄病毒R家族探針法qRT-LAMP引物-探針干粉 |
50次 |
0.5mL白蓋管 |
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人類內源性逆轉錄病毒R家族陽性對照（1E7拷貝/μL） |
250μL |
0.5mL黃蓋管 |
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超純水 |
1mL |
1.5mL藍蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產(chǎn)品采購五孔盒包裝 |
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注 意：引物干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入55 μL的超純水充分混勻和再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標準曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的RNA片段作為陽性對照。如果需要RNA陽性樣品，需要另外訂購。
稀釋標準曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的RNA片段作為陽性對照。如果需要RNA陽性樣品，需要另外訂購。
1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在6號管中加入5 μL 1E7拷貝/mL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
樣品RNA的制備
7. 用自選方法純化樣品RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)RNA提取試劑盒兼容，包括本公司的免提取的核酸釋放劑。
8. 如果有N個樣品，則需要做N+2個樣品制備，包括一個樣品制備陽性對照（PC）和一個樣品制備陰性對照（NC）。PC用10 μL本試劑盒提供的陽性對照（1E7拷貝/μL）加一定量的水充當，總體積必須核酸純化試劑盒所要求的起始樣品體積一樣，NC用水替代。
探針法qRT-LAMP反應20μL體系
9. 注意：第一次使用一個新的試劑盒時，必須先將100 μL逆轉錄酶-擴增酶混合液全部加入到qRT-LAMP MasterMix（探針法，待加酶）中，蓋上蓋子后輕柔顛倒1分鐘混勻，然后再取用。如果只做1次重復，則標記N+9個RT-LAMP管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-LAMP陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。
10. 反應設置：如果有N+2個RNA純化樣品，則設置N+4個qRT-LAMP擴增，增加qRT-LAMP陰性對照和qRT-LAMP陽性對照各1個。
11．本產(chǎn)品必須使用熒光PCR儀器進行擴增。設置60次循環(huán)，每次循環(huán)65℃保溫1分鐘，采集FAM通道的熒光信號。
結果分析
1. 若只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct值必須沒有讀數(shù)，或者大于或等于40。樣品制備陽性對照和qRT-LAMP陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有標準的S擴增曲線，Ct值應該小于40。樣品制備陰性對照和qRT-LAMP陰性對照Ct值必須沒有讀數(shù)、大于或等于40，如果小于40則為陽性。
2. 如果陽性和陰性對照結果正常，則實驗有效，可以分析樣品的情況。
若把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
自備試劑
待測樣品
待測樣品
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
