產(chǎn)品及特點(diǎn)
秀麗隱桿線蟲(chóng)是重要的模式生物，是研究多細(xì)胞真核生物細(xì)胞和分子生物學(xué)的材料。秀麗隱桿線蟲(chóng)有6對(duì)染色體，每條染色體都有端粒，其序列為T(mén)TAGGC，跟哺乳動(dòng)物的端粒TTAGGG非常相似，其長(zhǎng)度由端粒酶維持。目前最常用的檢測(cè)端粒酶活性的方法就是TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol，端粒重復(fù)片段擴(kuò)增)，它利用端粒酶能在底物DNA末端添加不同數(shù)量的序列這一特點(diǎn)，通過(guò)PCR檢測(cè)延伸產(chǎn)物而高效檢測(cè)端粒酶活性。但是傳統(tǒng)的TRAP方法為終點(diǎn)電泳檢測(cè)法，靈敏度低，沒(méi)法定量，同時(shí)還容易產(chǎn)生氣溶膠污染。為克服這些缺點(diǎn)，本公司開(kāi)發(fā)了基于探針?lè)╭PCR的TRAP試劑盒。它具有以下特征：
1. 即開(kāi)即用，提供從細(xì)胞裂解到qPCR所有試劑，免去自己優(yōu)化條件。
2. 基于探針?lè)晒舛縋CR，比電泳法TRAP靈敏度高。
3. 使用探針，專(zhuān)一性比電泳法TRAP高。
4. 提供陽(yáng)性對(duì)照，可以進(jìn)行基于此對(duì)照的定量分析。
5. 一管式操作，免去氣溶膠污染之憂。
6. 既可用于定量，又可用于定性。用于定量時(shí)線性范圍至少有5個(gè)數(shù)量級(jí)。
7. 既可用于培養(yǎng)細(xì)胞，也可用于實(shí)體組織（包括腫瘤組織）。
8. 本產(chǎn)品足夠50次20 μL體系的TRAP PCR檢測(cè)。
9. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分
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規(guī)格
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包裝
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TRAP專(zhuān)用細(xì)胞裂解液
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10mL
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10mL本色瓶
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2×TRAP專(zhuān)用qPCR MasterMix
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0.5mL
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0.5mL本色蓋
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熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液
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1.0mL
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1.5mL綠色蓋
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秀麗隱桿線蟲(chóng)TRAP檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照（1E7拷貝/μL）
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50μL
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0.5 mL黃色蓋
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秀麗隱桿線蟲(chóng)端粒酶底物干粉
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50次
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0.5 mL白色蓋
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秀麗隱桿線蟲(chóng)TRAP引物-探針干粉
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50次
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1.5 mL棕色管
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超純水
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1mL
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1.5 mL藍(lán)色蓋
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使用手冊(cè)
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1份
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無(wú)
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝
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注 意：首次使用本產(chǎn)品時(shí)需要在秀麗隱桿線蟲(chóng)端粒酶底物干粉中加入55μL的超純水；秀麗隱桿線蟲(chóng)TRAP引物-探針干粉管中加入165 μL的超純水。分別渦旋震蕩1分鐘溶解，短暫離心后放冰上待用。每次沒(méi)有用完的需要放-20℃保存。
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使用方法
一：稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品
以陽(yáng)性對(duì)照1E1-1E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6、5、4、3、2、1。
2. 在1-6號(hào)管中加入45 μL熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液。
3. 在6號(hào)管中加入5 μL 1E7拷貝/μL 的秀麗隱桿線蟲(chóng)TRAP檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號(hào)管中加入5 μL 1E5拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線陽(yáng)性樣品。放冰上待用。
二：端粒酶的提取
注 意：端粒酶的組成成分中有RNA，極容易被降解，因此，提取端粒酶應(yīng)該跟提取RNA一樣，盡量在低溫條件下快速操作、最好使用本公司的固相RNase清除劑預(yù)先清潔試驗(yàn)臺(tái)面等容易有RNase污染的地方。
7. 對(duì)冷凍的線蟲(chóng)：將50-100 mg在-80℃冷凍的線蟲(chóng)放裝有液氮的研缽中研磨成粉末，再轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入200 μL 預(yù)冷的TRAP專(zhuān)用細(xì)胞裂解液，溫和手動(dòng)勻漿6次后冰浴30分鐘，每間隔5分鐘渦旋振蕩一次，然后直接進(jìn)入第10步操作。
注意：為保證裂解效果，可在顯微鏡下觀察確保大部分細(xì)胞已經(jīng)裂解。如果線蟲(chóng)樣品不足50-100 mg，可以按比例降低TRAP專(zhuān)用細(xì)胞裂解液用量。在-20℃保存的線蟲(chóng)放置2個(gè)月后就失去端粒酶活性，而在-80℃保存的線蟲(chóng)放置數(shù)年還有端粒酶活性。
8. 對(duì)新鮮的培養(yǎng)線蟲(chóng)細(xì)胞：用自備的預(yù)冷PBS洗滌1E6個(gè)經(jīng)過(guò)胰酶處理的培養(yǎng)線蟲(chóng)細(xì)胞或50-100 mg經(jīng)過(guò)胰酶處理的新鮮線蟲(chóng)，3000 g 4℃離心5分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀可以直接使用，也可以放-80℃保存后續(xù)使用。在細(xì)胞沉淀中加入200 μL預(yù)冷的TRAP專(zhuān)用細(xì)胞裂解液，輕柔吹打3次懸浮細(xì)胞。對(duì)新鮮細(xì)胞：渦旋振蕩10秒后置冰浴30分鐘，每間隔5分鐘渦旋振蕩一次。對(duì)新鮮線蟲(chóng)：在冰上用玻璃勻漿器輕柔勻漿后冰浴30分鐘，每間隔5分鐘渦旋振蕩一次。如果細(xì)胞不足1E6或50-100 mg，按比例降低TRAP專(zhuān)用細(xì)胞裂解液用量。
9. 14000 g 4℃離心20分鐘，收集160 μL上清（含端粒酶），留40 μL不取。
10. 取部分上清液用自備BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。
11. 測(cè)出各樣品的蛋白濃度后，用TRAP專(zhuān)用細(xì)胞裂解液將各樣品的蛋白濃度調(diào)成3 μg/μL，然后分裝合適的量到離心管中，將實(shí)驗(yàn)所需的數(shù)量放冰上待用，其余的放-80℃長(zhǎng)期保存（可存放一年）。此步所得樣本稱(chēng)為端粒酶待測(cè)樣本。
12. 對(duì)每個(gè)樣本，一次實(shí)驗(yàn)需要兩管，一管用于測(cè)定端粒酶活性，一管用作該待測(cè)樣本的熱滅活陰性對(duì)照。制備方式是每個(gè)樣本取一管端粒酶待測(cè)樣本，95℃處理10分鐘滅活端粒酶，放冰上待用。沒(méi)有用完的可放-80℃長(zhǎng)期保存（可存放一年）供下次使用。
二：探針?lè)═RAP20 μL體系
1. 確定端粒酶待測(cè)樣本的：為便于比較，每個(gè)反應(yīng)所用的蛋白量總量（或?qū)?yīng)的細(xì)胞數(shù)）必須一樣，否則不好進(jìn)行樣本間的比較。
2. 設(shè)置反應(yīng)。如果有N個(gè)樣品，每個(gè)樣品做1次重復(fù)（一般建議作三個(gè)重復(fù)，此處為表述方便，假設(shè)只做1次重復(fù)），則需要準(zhǔn)備2N+6個(gè)反應(yīng)管。多1倍是因?yàn)槊總€(gè)樣本都需要一個(gè)對(duì)應(yīng)的熱滅活陰性對(duì)照。另外1個(gè)用作探針?lè)═RAP陰性對(duì)照，最后5個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本。按下表設(shè)置20μL體系的
三：結(jié)果分析
1. 實(shí)驗(yàn)的有效性判斷：如果標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本管的FAM信號(hào)結(jié)果為陰性（無(wú)Ct值，或者大于或等于35），則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)或跟廠家聯(lián)系。如果探針?lè)═RAP陰性對(duì)照管的FAM信號(hào)結(jié)果均為陽(yáng)性（有Ct值小于35），說(shuō)明環(huán)境污染，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。如果標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本管的FAM信號(hào)結(jié)果為陽(yáng)性，探針?lè)═RAP陰性對(duì)照管的結(jié)果為陰性，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入下步分析。
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：以5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本濃度的log值為橫軸，以陽(yáng)性對(duì)照（FAM通道）的Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)曲線為斜線，r2必須大于0.95。再以待測(cè)端粒樣品的Ct值從陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出待測(cè)端粒酶所合成的端粒重復(fù)序列的拷貝數(shù)的log值，再有此log值推算出新合成的端粒重復(fù)序列拷貝數(shù)。由于新合成的端粒DNA重復(fù)序列的拷貝數(shù)跟端粒酶的活性相關(guān)。因此端粒酶活性大小跟測(cè)試的Ct呈現(xiàn)反相關(guān)，同一次實(shí)驗(yàn)所得的Ct值可以用來(lái)比較各所測(cè)各樣本中端?；钚缘南鄬?duì)大小。
自備試劑
樣品DNA，超純水，核酸純化試劑盒
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年
購(gòu)物車(chē)
幫助
021-54845833/15800441009
