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021-54845833/15800441009
馬組織金屬蛋白酶抑制因子2(TIMP2)ELISA試劑盒
簡介
基質金屬蛋白酶抑制因子2（TIMP-2）是一個基因和一個相應的蛋白質。該基因是TIMP基因家族的一個成員。該蛋白被認為是一種轉移抑制因子。該基因家族所編碼的蛋白是基質金屬蛋白酶（MMP）的天然抑制劑，MMP是一組參與細胞外基質降解的肽酶。除了對金屬蛋白酶的抑制作用外，所編碼的蛋白在TIMP家族成員中具有獨特的作用，它能夠直接抑制內皮細胞的增殖。因此，該編碼蛋白可能通過抑制靜止組織對血管生成因子的增殖，以及抑制細胞外基質重塑的組織中的蛋白酶活性，對維持組織的穩(wěn)態(tài)至關重要。TIMPs抑制活躍的MMPs，但不同的TIMPs對不同的MMPs的抑制作用比其他的好。
檢測原理
本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術:將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物TIMP2，清洗后，再加入生物素標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中TIMP2的濃度。
需要的其他材料
1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。
樣品保存
樣品收集后若在 1 周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測），或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
試劑準備工作
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標準品配置
試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從10μg/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至500ng/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的500ng/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將500ng/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為： 500ng/mL、 250ng/mL、 125ng/mL、62.5ng/mL、 31.25ng/mL、 15.625ng/mL、 7.81ng/mL，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ng/mL)。
試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從10μg/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至500ng/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的500ng/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將500ng/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為： 500ng/mL、 250ng/mL、 125ng/mL、62.5ng/mL、 31.25ng/mL、 15.625ng/mL、 7.81ng/mL，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ng/mL)。
抗體工作液配置
使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據所需用量當日配置當日使用。
使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據所需用量當日配置當日使用。
酶結合物工作液配置
使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據所需用量配置。
使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據所需用量配置。
備 注：如待測樣本中TIMP2濃度高于標準品最高值，請根據實際情況選擇適當的稀釋倍數。
以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗數據建立標準曲線。
下圖所示標準曲線僅供示例，結果計算應以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結果
重復性
結果的計算
計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮颠壿嫞?-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。
若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。
示例數據
以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗數據建立標準曲線。
|
標準品濃度(ng/mL) |
500 |
250 |
125 |
62.5 |
31.25 |
15.625 |
7.81 |
0 |
|
OD值 |
2.479 |
1.744 |
0.937 |
0.655 |
0.417 |
0.211 |
0.197 |
0.064 |
|
校正OD值 |
2.415 |
1.68 |
0.873 |
0.591 |
0.353 |
0.147 |
0.133 |
0 |
下圖所示標準曲線僅供示例，結果計算應以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結果
重復性
板內變異系數小于10%，板間變異系數小于10%。
靈敏度
經樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為3.91ng/mL。
特異性
該試劑盒測定可識別重組馬TIMP2。
